Povestea are loc într-o istorie ficțională și relatează conflictul etern dintre Asasini, care luptă pentru pace prin liber-arbitru, și Templieri, care doresc pacea prin control. Povestea din "prezent" are loc în secolul 21 și îl urmărește pe Desmond Miles care, cu ajutoul unei mașinării numite Animus, retrăiește aminitirile genetice ale strămoșilor săi pentru a preveni apocalipsa din 2012. Povestea principală are loc imediat după întâmplările din Assassin's Creed II, și îl are în prim-plan pe Asasinul Ezio Auditore de Firenze în Italia de secol 16, care încearcă să restabilească ordinul Asasinilor și să-și distrugă inamicii: familia Borgia.
Assassin's Creed: Brotherhood are loc într-o lume open world, este prezentat dintr-o perspectivă third-person, și se focusează pe abilitățile de luptă și stealth ale lui Desmond și Ezio pentru a elimina țintele și a explora mediul. Ezio este liber să navigheze prin Roma secolului 16 pentru a completa misiunile secundare, independente de povestea principală. Jocul a introdus o componentă de multiplayer în serie, zugrăvită ca un program de antrenare cu Templieri.